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Nature

volume 592, Â pages195â ???? 204 (2021) Citer cet article

Le passage de la lecture à l’écriture du génome humain offre de nouvelles opportunités pour améliorer la santé humaine Le consortium SCGE (Somatic Cell Genome Editing) des National Institutes of Health (NIH) des États-Unis vise à accélérer le développement de méthodes plus sûres et plus efficaces pour modifier les génomes des cellules somatiques pertinentes pour la maladie chez les patients, même dans les tissus difficiles à atteindre Nous discutons ici des plans du consortium pour développer et comparer des approches pour induire et mesurer des modifications du génome, et pour définir les conséquences fonctionnelles en aval de l’édition du génome dans les cellules humaines. Au cœur de cet effort se trouve une approche rigoureuse et innovante qui nécessite la validation de la technologie par des tests tiers sur petits et grands animaux. De nouveaux éditeurs de génome, des technologies de livraison et des méthodes pour suivre les cellules éditées in vivo, ainsi que des modèles animaux et des systèmes biologiques humains nouvellement développés, seront assemblésavec des ensembles de données validésdans une boîte à outils SCGE, qui sera largement diffusé auprès de la communauté de la recherche biomédicale Nous visualisons cette boîte à outils et les connaissances générées par ses applications comme un moyen d’accélérer le développement clinique de nouvelles thérapies pour un large éventail de conditions.

Les facteurs génétiques contribuent à la plupart des catégories de maladies humaines, y compris celles héréditaires, infectieuses et malignes Un objectif de longue date de la science biomédicale est donc de développer un moyen de modifier les génomes chez les patients afin de corriger les mutations pathogènes, de désactiver les génomes des agents pathogènes envahisseurs, d’armer les cellules immunitaires pour attaquer les tumeurs et de permettre d’innombrables autres opportunités thérapeutiques. In some cases, l’ajout de gènes peut avoir une valeur thérapeutique et la thérapie géniquele domaine qui développe cette approcheconnaît un succès toujours croissant1 Dans de nombreux autres cas, however, le génome du patient doit être modifié pour obtenir un bénéfice thérapeutique L’édition du génome englobe globalement diverses technologies qui peuvent apporter de nombreuses modifications génomiques différentes dans différents contextes, et le sujet a fait l’objet d’examens récents et complets2,3,4. Plusieurs concepts d’édition du génome (Fig 1) sont au cœur des objectifs et des stratégies du Consortium SCGE, que nous décrivons dans cette perspective

Les activités du Consortium SCGE convergent vers l’édition du génome des cellules à l’intérieur du corps humain a, Les cibles des éditeurs du génome (to the right) vont de l’ADN dans le noyau d’une cellule à d’autres acides nucléiques ailleurs dans une cellule, comme l’ADN dans les mitochondries (ADNmt) ou l’ARN dans le cytoplasme Les cibles des éditeurs épigénomiques (to the left) produisent une altération ciblée de la structure de la chromatiney compris le remodelage, la modification de la structure 3D et la modification directe des histones ou de l’ADNsans modifier la séquence d’ADN ou d’ARN Les approches d’édition des cellules en dehors du corps, ainsi que l’édition de la lignée germinale dans les embryons, ne sont pas directement soutenues par le Consortium SCGE, pas plus que les stratégies d’augmentation génique par l’ajout d’ADN exogène. b, des outils interopérables assemblés dans une boîte à outils SCGE seront diffusés pour accélérer la traduction de thérapies d’édition du génome sûres et efficaces dans la clinique Les outils englobent plusieurs catégories: les éditeurs de génome nouvellement développés, les technologies de livraison, les systèmes rapporteurs-animaux et les systèmes biologiques humains

Au cours des dernières décennies, une progression constante de techniques et de technologies permettant la modification du génome programmable par l’utilisateur a été introduite, testée, améliorée et mise en œuvre Il s’agit notamment de la recombinaison homologue, des nucléases à doigt de zinc (ZFN), des méganucléases et des nucléases effectrices de type activateur de transcription (TALEN) 5,6,7 More recently, machinerie moléculaire conçue8,9,10,11,12,13,14,15 dérivée de voies immunitaires bactériennesâ ???? connu sous le nom de répétitions palindromiques courtes régulièrement espacées (CRISPR) et de protéines associées à CRISPR (Case) (CRISPRâ Systèmes Cas) 16â ???? ont révolutionné l’édition du génome2,3,4, en partie parce que leurs séquences cibles peuvent être simplement programmées avec des guides ARN faciles à concevoir Malgré ces avancées prometteuses, des défis restent à relever avant que le potentiel de transformation de l’édition thérapeutique du génome ne puisse être pleinement réalisé Ici, nous décrivons les objectifs et les stratégies du Consortium SCGE, qui a été établi par le NIH des États-Unis pour accélérer le développement de solutions à nombre de ces défis. Le NIH a alloué environ 190 millions de dollars américains sur 6 ans pour soutenir le Consortium SCGE, which now includes 72 chercheurs principaux de 38 institutions qui poursuivent 45 projets distincts mais bien intégrés.

Jusqu’à la dernière décennie, les plates-formes d’édition du génome les plus importantes (ZFN, méganucléases, TALEN et systèmes Cas9 / Cas12a) reposaient presque exclusivement sur la prise de conscience17 que la réparation des ruptures du génome induites par la nucléase pouvait être exploitée pour induire le génome modifications (Fig 1a) – soit des knockouts géniques (par insertions ou délétions générées par une jonction d’extrémité non homologue (NHEJ) ou une jonction d’extrémité médiée par microhomologie) ou une correction précise par réparation dirigée par homologie (HDR) 18 Certains événements d’édition impliquent l’insertion de «cargo» dérivé de vecteurs. séquences dans le génome: des exemples naturels de recombinases et de transposases qui peuvent accomplir cette tâche ont été étudiés pendant des décennies, et certains (for example, les vecteurs lentiviraux) sont appliqués pour la thérapie génique et l’édition du génome19 De plus, certaines plates-formes peuvent être mises en œuvre sous des formes partiellement ou totalement inactives à la nucléase, en se fixant à d’autres protéines effectrices20 Ces stratégies comprennent l’édition de base21 (dans laquelle des enzymes de désaminase fusionnées réécrivent des nucléotides individuels sans induire de cassures double brin) 22,23,24 et l’édition primaire (dans laquelle une transcriptase inverse fusionnée introduit des modifications basées sur un ARN guide étendu) 25 Les formes nucléases inactives peuvent également être fusionnées à des enzymes pour modifier la chromatine sans changer la séquence d’ADN26,27 (Fig 1a) Of course, aucune plate-forme n’est appropriée pour tous les contextes, et les facteurs critiques pour le succès de l’édition incluent l’efficacité (la fraction des locus prévus qui sont édités), la précision (la fréquence relative du désir (for example, la réversion d’un allèle pathogène) par rapport à ce qui n’est pas désiré. (for example, de grandes suppressions ou translocations) des modifications aux locus prévus) et de la précision (combien de sites hors cible sont modifiés involontairement et dans quelle mesure)

L’édition du génome des cellules somatiques peut être effectuée soit ex vivo, suivie de la réintroduction des cellules éditées chez le patient, soit in vivo, en fournissant la machinerie d’édition aux tissus du corps Une distinction importante est la modification des tissus somatiques par rapport aux tissus de la lignée germinale: ce dernier a le potentiel de transmettre des changements génétiques aux générations futures. Le Consortium SCGE est strictement axé sur l’édition somatique; La modification de la lignée germinale n’est pas seulement exclue en tant qu’objectif, mais est également considérée comme un résultat inacceptable qui doit être soigneusement évité

Les technologies d’édition du génome ont déjà démontré leur efficacité dans divers modèles animaux de maladies, y compris le cancer, les troubles sanguins et métaboliques, les formes héréditaires de cécité et de surdité et les maladies neuromusculaires et neurologiques2,28,29,30 Ces succès ont justifié le passage à des modèles animaux de grande taille, dans lesquels des signes d’efficacité ont également été trouvés31,32,33 Des essais cliniques à un stade précoce ont montré que les cellules autologues éditées peuvent se greffer de manière stable et persister chez l’homme34,35,36, et il y a eu des rapports préliminaires sur l’édition ex vivo de cellules T allogéniques pour lutter contre le cancer37 ainsi que sur l’utilisation de souches hématopoïétiques autologues cellules pour éliminer le besoin de transfusions sanguines chez les patients atteints de drépanocytose Cependant, l’édition ex vivo est complexe sur le plan logistique, coûteuse et difficile à mettre à l’échelle, compte tenu de son besoin d’une infrastructure de fabrication de cellules substantielle. Therefore, des approches in vivo pour l’édition de cellules somatiques sont en cours de développement29, et les cibles initiales incluent des types de cellules difficiles à fabriquer ex vivo (for example, dans la rétine (essais cliniquesidentifiant gov NCT03872479) et dans le foie (NCT03041324 et NCT04601051)) Ces études mettent en évidence le grand potentiel de l’édition du génome pour améliorer la santé humaine Cependant, ils soulignent également la nécessité de s’attaquer aux principales limites de ces technologies Plus précisément, l’édition in vivo se heurte toujours à des obstacles importants en termes d’efficacité et de sécurité, en particulier dans les systèmes organiques au-delà de l’œil et du foie.

Pour réussir in vivo, les éditeurs doivent être en mesure d’induire une gamme de modifications de tout acide nucléique cible dans la cellule, y compris l’ADN nucléaire et mitochondrial. Les éditeurs doivent être très efficaces mais également sûrs, avec des niveaux de toxicité acceptables et une activation minimale des réponses immunitaires innées L’immunité adaptative à l’éditeur38,39,40,41 ou au véhicule d’administration42,43 doit également être gérée, en particulier dans les cas où une ré-administration pourrait être nécessaire pour modifier une proportion souhaitée d’une population de cellules cibles De même, l’immunité préexistante peut devoir être supprimée ou contournée dans certains cas44,45,46,47 Un défi particulièrement redoutable consiste à développer des technologies de livraison capables de transporter les machines d’édition vers de nombreux tissus de manière sûre et efficace. Nous cherchons à mieux contrôler les changements génomiques précis que nous avons l’intention de créer sur chaque site ciblé, à réduire le potentiel de modifications involontaires sur les sites ciblés et non ciblés, et à mieux comprendre les conséquences biologiques des événements d’édition involontaires. Ces besoins non satisfaits sont traités par les initiatives du Consortium SCGE, comme expliqué ci-dessous

Malgré la promesse de changer n’importe quelle séquence d’ADN dans le génome, les nucléases programmables actuelles sont les plus efficaces pour le knock-out de gène ou pour l’excision de régions spécifiques de l’ADN génomique En fait, de nombreuses approches d’édition de gènes pour le traitement des maladies causées par des mutations dans un seul gène, telles que la drépanocytose, la thalassémie β, la dystrophie musculaire de Duchenne et l’amaurose congénitale de Leber? ? ne sont pas destinés à corriger la mutation héréditaire ou à restaurer le gène affecté à une séquence de type sauvage Au lieu de cela, ils sont conçus pour éliminer les éléments génomiques répressifs qui conduiront à la régulation à la hausse des facteurs compensatoires48, pour éliminer les exons qui conduiront à la production d’un produit génique partiellement fonctionnel49,50,51, ou pour éliminer les jonctions d’épissage aberrantes32 L’incapacité actuelle à programmer facilement et avec précision des séquences spécifiques dans le génomeétant donné que le HDR est largement inefficace dans les cellules différenciées post-mitotiques18est un obstacle fondamental à l’utilisation généralisée de l’édition du génome dans le traitement de la génétique maladie En conséquence, les nouvelles technologies qui permettent des modifications spécifiques aux séquencestelles que l’édition de base22,23 et l’édition principale25font également partie du portefeuille de projets du Consortium SCGE. In fact, l’édition de base a déjà été utilisée pour corriger des mutations pathogènes et, in some cases, a abouti à un sauvetage phénotypique de la maladie52,53,54,55,56,57,58,59,60,61,62,63

Au-delà des nouvelles capacités d’édition, il existe de nombreuses autres limitations techniques qui doivent être surmontées pour faire avancer le domaine Par exemple, des progrès importants ont été réalisés ces dernières années dans la prédiction, la caractérisation et la validation d’éventuelles modifications hors cible64, en s’appuyant sur les travaux de base avec les ZFN65. However, toutes ces méthodes sont intrinsèquement incomplètes, car il n’est pas possible de réaliser un séquençage non destructif du génome entier de chaque cellule éditée. Likewise, la plupart des approches sont basées sur la technologie de séquençage en profondeur, et sont donc limitées par les biais de réaction en chaîne par polymérase, les sensibilités, les longueurs de lecture et les taux d’erreur de ces méthodes. Moreover, les effets hors cible, les événements indésirables (for example, les intégrations de vecteurs, les suppressions importantes, les réarrangements ou les translocations), la génotoxicité et d’autres réactions indésirables aux éditeurs de génome peuvent ne pas être entièrement mesurables dans les modèles animaux. Pour ces raisons, le développement de méthodes pour détecter les événements génomiques indésirables avec une capacité prédictive et une sensibilité accrues, ainsi que des systèmes cellulaires et tissulaires humains tels que les organoïdes, sont des composants importants du programme SCGE.

L’obstacle le plus important au développement de thérapies d’édition de gènes est la mise en place de stratégies d’administration sûres et efficaces Le domaine de l’édition du génome peut tirer parti de quatre décennies d’innovation dans les domaines de la thérapie génique1 et de la thérapeutique des acides nucléiques66, qui ont abouti au développement de nombreuses approches d’administration virale et non virale. In fact, les récentes approbations réglementaires de thérapies géniques utilisant à la fois des virus adéno-associés (AAV) et des vecteurs de lentivirus, ainsi que des médicaments à base d’ARN interférent court (siRNA) et antisens, fournissent des leçons qui sont applicables aux éditeurs de génome. However, bon nombre des vecteurs qui ont été développés pour la thérapie génique, qui se concentre généralement sur l’expression à long terme pour compenser les défauts génétiques, ne sont pas nécessairement optimaux pour l’édition génique, qui nécessite souvent une livraison transitoire d’éditeurs. Les éditeurs les plus fréquemment utilisés présentent également d’autres défis, notamment leurs grandes tailles (SpyCas9 et TALEN), leurs séquences répétitives et la nécessité de fournir les deux composants d’un hétérodimère (ZFN et TALEN), et l’exigence de délivrance d’un complexe ribonucléoprotéique (RNP ; par exemple dans CRISPR) Finally, le risque d’activité sur cible ou hors cible dans des tissus inappropriés souligne la nécessité d’assurer un ciblage tissulaire approprié Collectivement, ces défis offrent des opportunités d’innovation considérables

Après avoir passé en revue l’état du terrain en 2017 à travers une série d’ateliers avec les parties prenantes, le Fonds commun des NIH a noté des besoins couvrant plusieurs indications cliniques, gènes et tissus cibles67 Le consensus était que le domaine avait besoin de nouveaux éditeurs de génome, de systèmes de délivrance et de systèmes biologiques pour mesurer l’innocuité et l’efficacité de diverses stratégies d’édition du génome. Le Fonds commun a ensuite lancé le Consortium SCGE en 2018, en réunissant un ensemble d’équipes multidisciplinaires travaillant sur des projets individuels conçus pour répondre à ces besoins.

L’objectif primordial du consortium SCGE est d’accélérer la traduction de la technologie d’édition du génome dans un large éventail de tissus et de maladies L’un des principaux défis dans le domaine est la comparaison de diverses technologies à l’aide de mesures et de normes communes Par exemple, un système de délivrance rétinienne pourrait produire des indels ciblés sur un gène d’intérêt, mais il n’est pas clair si le même système de délivrance pourrait corriger un gène différent dans le poumon. Des chemins de développement qui permettent le mélange et l’appariement de diverses technologies et lectures sont tissés dans le programme SCGE Dans un exemple, toutes les nouvelles technologies de livraison développées au cours des trois premières années du programme seront d’abord testées sur de petits animaux (for example, des souris), then – en cas de succèssur de gros animaux tels que les porcs et non -les primates humains Les données tierces qui en résultent seront partagées avec la communauté de recherche dans son ensemble et avec le public Une valeur clé du Consortium SCGE est la transparence, qui permet aux autres d’accéder à ses résultats de recherche et d’utiliser ses résultats et produits pour informer et accélérer leurs propres projets axés sur la maladie. En plus des données, nous visons à fournir une collection d’outils, de réactifs, de méthodes et de meilleures pratiques qui seront assemblées dans la boîte à outils SCGE pour l’édition thérapeutique du génome (ou la boîte à outils SCGE en bref, Fig 1b) À travers ces activités et livrables, le Consortium SCGE cherche à avoir un impact durable en réduisant le temps et les coûts nécessaires pour développer de nouvelles thérapies

La découverte de nouveaux outils d’édition de gènes et leur ingénierie continuent de progresser rapidement En tant que tel, nous cherchons à découvrir de nouveaux éditeurs et à nous appuyer sur les éditeurs existants, en partie en les optimisant pour une précision accrue (Fig 2) Bien que l’essentiel des études SCGE se concentrera sur le système CRISPR qui est déjà le plus largement utilisé (SpyCas9), ainsi que sur d’autres homologues établis Cas9 et Cas12a68,69,70,71,72,73,74,75,76,77 , 78,79, il est impératif de continuer à identifier et tester de nouveaux systèmes et outils associés Par exemple, les nouveaux systèmes CRISPRâ ???? Cas auxquels les humains n’ont pas été précédemment exposés80â ???? ainsi que les éditeurs de gènes basés uniquement sur des analogues d’acide nucléique qui ne nécessitent pas de cofacteurs protéiques81â ???? pourraient servir à contourner détection par le système immunitaire et facilite également l’accouchement En recherchant dans les données microbiennes obtenues à partir d’échantillons non cultivés, nous espérons identifier de nouveaux systèmes qui peuvent être exploités pour la manipulation d’ADN tels que les hélicases, nucléases, transposases ou recombinases80,82,83,84,85,86 Ces nouveaux systèmes pourraient fournir des ressources avec une efficacité améliorée, des mécanismes de ciblage alternatifs, des cargaisons plus petites pour l’empaquetage viral ou une immunogénicité réduite. Cette approche est illustrée par le développement récent de Cas12j, le plus petit système d’édition du génome CRISPRâ ???? Cas jamais découvert, qui a été soutenu par le programme SCGE87

Les principales classes d’éditeurs de génome comprennent les nucléases, les éditeurs de bases (BE), les éditeurs principaux, les PNA, les éditeurs d’ARN et les éditeurs d’épigénome. Le développement de nouveaux éditeurs implique l’extraction d’ensembles de données métagénomiques et de s’appuyer sur les éditeurs existants, en partie en les optimisant pour une précision et une précision accrues. DNMT, ADN méthyltransférase; Acr, protéine anti-CRISPR; RT, transcriptase inverse; DN1S: mutant dominant négatif de la protéine de liaison à p53 suppresseur de tumeur 1, 53BP1; TALE-fusions, fusion effectrice de type activateur de transcription avec des nucléases ou des cytidine désaminases (DddA)

En plus de la découverte de nouveaux systèmes CRISPRâ ???? Case, nous continuerons à développer et à améliorer des plates-formes d’ingénierie – for example, l’édition de base21qui éditent efficacement les génomes, y compris en post-mitotique cellules et dans l’ADN mitochondrial24 Des éditeurs de base bien établis peuvent catalyser des transitions C-à-T (éditeurs de base cytosine (CBE)) 22, des transitions A à G (éditeurs de base adénine (ABE)) 23, ou les deux88,89,90; très récemment, les transversions C-à-G dans les cellules de mammifères ont également été activées par l’édition de base91,92 Idéalement, les modifications programmées pourraient changer n’importe quel nucléotide à n’importe quelle position dans le génome; however, lors de l’utilisation d’effecteurs CRISPRâ ???? Case, les bases modifiables sont limitées aux régions proches d’une séquence de motifs adjacente à un protospacer compatible De plus, les séquences modifiables sont limitées à une fenêtre qui est à une distance définie du motif adjacent au protospacer Grâce à une évolution dirigée, à l’extraction de variations naturelles ou à une ingénierie rationnelle, nous visons à développer à la fois des capacités de ciblage plus larges et une spécificité accrue. Finally, nous souhaitons éliminer les limitations des modifications des nucléotides ciblables Le premier montage, développé en partie via le programme SCGE, est un exemple d’une telle technologie25

Utilisation des systèmes CRISPRâ ???? Cas comme «curseurs ADN» nous permet d’apporter des modifications non seulement à la séquence nucléotidique de l’ADN, mais également aux marques épigénétiques qui peuvent modifier les profils d’expression génique et finalement influencer la fonction cellulaire93 Tout comme les éditeurs de base, les nouveaux systèmes CRISPRâ ???? Cas ou les variantes qui fournissent de nouveaux sites de liaison peuvent améliorer l’accessibilité de ces nouveaux outils à toutes les régions de l’épigénome, et il reste beaucoup à apprendre et à développer pour d’abord comprendre puis améliorer le spécificité des éditeurs d’épigénome Une telle approche étend la boîte à outils de l’ingénierie du génome pour s’appliquer à un ensemble beaucoup plus large de maladies, qui peuvent être traitées par des changements dans l’expression des gènes93,94 ou par la reprogrammation des phénotypes cellulaires95 Les modalités d’édition de l’épigénome présentent d’autres avantages potentiels, notamment l’activation de gènes et de réseaux endogènes pour les phénotypes à gain de fonction, ainsi que l’accordabilité, la réversibilité et l’élimination de la possibilité de mutations hors cible ou de génotoxicité

Bien que le Consortium SCGE se concentre considérablement sur les systèmes liés à CRISPRâ ???? Case, il est crucial de continuer à explorer des systèmes alternatifs, en partie parce qu’ils pourraient différer à la fois dans leur potentiel de délivrance et dans leur réponses immunologiques qu’ils suscitent À titre d’exemple, les acides nucléiques peptidiques (PNA) sont des molécules synthétiques relativement petites qui reconnaissent des séquences d’ADN spécifiques par formation de triplex et induisent par la suite l’édition96 Le consortium SCGE développe des méthodes améliorées pour la production de PNA, en plus de modificateurs qui pourraient améliorer la fonction des PNA pour l’édition de l’ADN, et une analyse robuste de la fonction de PNA dans de nombreux loci génétiques97,98 Des systèmes alternatifs pourraient également cibler les nombreux génomes mitochondriaux distincts avec des cellules humaines Ces génomes sont largement inaccessibles à l’édition par des systèmes qui nécessitent des ARN guides ou des donneurs d’ADN, en raison du manque actuel de méthodes fiables pour transporter ces classes de molécules dans les mitochondries. L’ingénierie des éditeurs qui ciblent l’ADN mitochondrial pourrait ouvrir des thérapies d’édition du génome pour le traitement des maladies mitochondriales, qui affectent 1 personne sur environ 500024,99 La découverte de DddA ™, une toxine interbactérienne qui catalyse la désamination sans précédent des cytidines dans l’ADN double brin, a conduit au développement de CBEs dérivées de DddA (DdCBE) sans ARN, qui ont permis les premiers changements de séquence ciblés. dans l’ADN mitochondrial24 En plus des DdCBE, d’autres outils à base de protéines tels que les doigts de zinc100,101,102 et les effecteurs de type TAL103,104 sont fusionnés à des nucléases pour contrôler l’hétéroplasmie du génome mitochondrial

Quel que soit le système d’édition du génome sélectionné pour éditer un locus thérapeutique particulier, sa traduction vers la clinique est actuellement limitée par la capacité de la charge utile d’édition à atteindre les noyaux des cellules cibles Ce goulot d’étranglement translationnel présente des défis multiformes qui diffèrent d’un tissu cible à l’autre Une plate-forme de distribution idéale serait capable de transporter les composants macromoléculaires requis à travers les limites cellulaires et dans le noyau; capable d’induire des niveaux d’édition thérapeutiquement utiles; se prêtant à une production rentable, reproductible et évolutive; spécifique pour des types de cellules particuliers; et compatibles avec des seuils acceptables de toxicité, de génotoxicité et d’immunogénicité Le non-respect de l’un de ces critères pourrait rendre les stratégies de livraison des candidats inefficaces, inaccessibles ou dangereuses Après des décennies d’efforts de recherche consacrés à la délivrance thérapeutique d’ADN ou d’ARN, les vecteurs viraux et les nanoparticules lipidiques sont devenus des plates-formes prometteuses105,106,107 à travers lesquelles fournir des machines d’édition du génome Cependant, de nombreuses plates-formes existantes présentent des limites pratiques pour une utilisation clinique, comme le souligne l’offre modeste de thérapies génétiques malgré d’importants efforts universitaires et industriels. for example, l’utilisation clinique de l’AAV comme vecteur pour la délivrance d’ADN qui code les composants d’un éditeur (for example, un effecteur de protéine Cas et son ARN guide) est entravée par des goulots d’étranglement de fabrication, des tropismes de tissus cibles limités, une mutagenèse insertionnelle et l’immunogénicité des protéines virales106 Pour les systèmes CRISPR en particulier, la capacité limitée de conditionnement du génome peut être un autre problème majeur106 Les nanoparticules constituées de molécules cationiques et hydrophobes, chargées d’ARN messager (ARNm) et d’ARN guide, fournissent des stratégies alternatives et peuvent être tout aussi efficaces que les vecteurs viraux en termes d’efficacité d’édition108,109,110 Cependant, la large application de l’édition du génome nécessitera des nanoparticules capables de cibler les nombreux types de tissus du corps.

Pour répondre à ces besoins, le Consortium SCGE travaille sur 20 projets distincts qui exploreront de nouvelles méthodes pour la fourniture de machines d’édition du génome à des types de tissus spécifiques in vivo (Tableau 1) Les vecteurs viraux existants sont améliorés avec une capacité de ciblage tissulaire améliorée, permettant une efficacité élevée à des doses plus faibles De même, les nanoparticules sont augmentées avec des molécules qui conduisent une association spécifique au type de cellule, générant de puissants systèmes de retour qui peuvent être administrés par voie intraveineuse ou localement. L’administration de RNP CRISPR préformés a montré la capacité de modifier les cellules épithéliales respiratoires à l’aide de peptides pénétrant dans les cellules amphiphiles111, de cellules rétiniennes112 et de neurones dans le cerveau113, pour lesquels l’administration améliorée par convection pourrait augmenter la distribution tissulaire. Une approche hybride associera des nanoparticules à un AAV qui porte l’ADN modèle pour faciliter le HDR114 Les particules de type virus constituent une stratégie chimérique: les supports dérivés du virus sont emballés avec des RNP préformés, ce qui permet de maintenir potentiellement l’efficacité de la délivrance sans l’expression prolongée de la machinerie d’édition qui est potentiellement associée à une génotoxicité et une immunogénicité accrues D’autres stratégies prometteuses comprennent l’utilisation de vésicules extracellulaires, des ultrasons, des peptides pénétrant dans les cellules amphiphiles ou des modifications chimiques des composants de l’ARN105,107,115 pour améliorer l’administration ciblée in vivo (board 1)

Les modèles animaux fournissent une validation essentielle des systèmes de livraison au sein d’un organisme vivant Ces modèles servent également de terrain d’essai pour de nouvelles thérapies et un système de détection des événements indésirables, y compris la toxicité et l’immunogénicité. Les études d’efficacité et d’innocuité chez l’animal spécifiques à une indication cible sont actuellement considérées comme essentielles par les autorités réglementaires aux États-Unis et dans l’Union européenne pour presque toutes les thérapies d’édition du génome qui sont avancées en clinique. L’un des objectifs du programme SCGE est de générer des systèmes rapporteurs in vivo qui sont largement applicables à de nombreux systèmes de délivrance et technologies d’édition, indépendamment du type de cellule ou de tissu cible, ou de la maladie spécifique à corriger. Ces reporters devraient avoir la capacité de détecter et de quantifier l’édition du génome dans le tissu cible prévu, ainsi que l’édition d’événements résultant d’une administration non spécifique à d’autres tissus dans tout le corps.

Les centres d’expérimentation pour petits et grands animaux (SATC et LATC, respectively) au sein du consortium SCGE centralisent l’expertise avec les modèles animaux (board 2) pour aider les chercheurs à évaluer l’efficacité, la spécificité et la sécurité des nouvelles formulations de délivrance à la fois dans la nature. types et modèles animaux rapporteurs Par exemple, les deux SATC développent des systèmes de rapporteurs de souris, car les souris sont un outil idéal pour les tests préliminaires de nouvelles formulations d’administration étant donné leur petite taille, leurs faibles coûts et leur utilité bien établie. Les grands animaux sont nécessaires pour la détermination préclinique de l’innocuité, de l’efficacité, du dosage et de la distribution des réactifs, et comme alternatives aux modèles murins lorsque les souris ne récapitulent pas correctement les réponses humaines Les nucléases modifiées ont permis une modification génétique efficace et précise de grands animaux, tels que les primates et les porcs non humains Trois équipes de recherche du Consortium SCGE développent des systèmes de rapporteurs in vivo pour grands animaux: un groupe est dédié aux porcs et deux autres sont dédiés aux primates non humains, en particulier les marmousets et les singes rhésus. Le rôle des LATC est d’évaluer l’efficacité et la sécurité des technologies d’édition et de délivrance du génome in vivo, dans un premier temps chez les animaux de type sauvage Lorsque les équipes de recherche qui créent et évaluent les animaux rapporteurs ont atteint leurs objectifs, elles fourniront les animaux rapporteurs aux LATC pour effectuer une validation indépendante et établir de grandes cohortes pour les tests des éditeurs de génome.

Les modèles animaux rapporteurs sont conçus pour s’activer fidèlement dans toutes les cellules et tous les tissus en réponse à un événement d’édition de gène spécifique Les protéines fluorescentes fournissent un moyen simple et robuste de détecter l’activité au niveau de la cellule unique in situ, permettant l’identification des types de cellules spécifiques qui sont ciblés Les journalistes peuvent être conçus pour détecter différents types d’activité d’édition, souvent avec une disposition multifonctionnelle pour permettre la flexibilité de l’utilisateur Cela comprend l’activité de nucléase par la détection d’événements de réparation médiés par NHEJ, ainsi que le HDR d’une protéine rapporteur inactivée La capacité de détecter l’activité de plusieurs nucléases (for example, SpyCas9, Cas12a et autres) est hautement souhaitable pour permettre des études comparatives En incarnant ces principes, les systèmes de rapporteurs SCGE (board 2) sont principalement conçus comme des variantes améliorées du système Ai950, 116 ou ont un «reporter aux feux de signalisation». conception D’autres modèles permettront de détecter les activités d’autres types d’éditeurs, y compris les ABE et CBE21 et les systèmes d’édition basés sur PNA96,97,98 Des cassettes de reporters supplémentaires, telles que l’Akaluciférase119 ou les symporteurs d’iodure de sodium120, seront incluses pour permettre la détection longitudinale par des plates-formes d’imagerie distinctes. Il est important de noter que tous les nouveaux animaux rapporteurs créés dans le cadre du programme SCGE seront disponibles pour distribution à la communauté biomédicale au sens large.

Parallèlement au développement de nouveaux organismes modèles, de nouvelles méthodes non invasives sont nécessaires pour mesurer les résultats associés à l’édition Le Consortium SCGE développe des techniques pour le suivi cellulaire in vivo à l’aide de méthodes d’imagerie avancées, y compris l’imagerie par tomographie par émission de positons (TEP) du corps total121, l’imagerie par particules magnétiques (MPI) 122 et l’imagerie par résonance magnétique par transfert de saturation par échange chimique (CEST MRI) 123, comme décrit dans le tableau 3 Les projets en cours permettront un suivi quantitatif des emplacements et du devenir des cellules modifiées par le génome après implantation in vivo124,125,126,127 ou administration à l’aide d’approches de marquage cellulaire (MPI / MRI) 128 et de gène rapporteur (IRM / PET) 129,130,131,132 In addition, le suivi de la livraison et de la transduction de la cargaison d’édition de gènes à l’aide de protéines de capside AAV comme mécanismes de contraste endogènes CEST IRM est en cours d’examen. Chacune de ces méthodes peut être réalisée parallèlement à une imagerie non invasive standard existante pour évaluer les réponses inadaptées au traitement. Ensemble, ces outils fourniront une puissante combinaison de méthodes pour quantifier et lier la livraison de la technologie d’édition de gènes ou des cellules modifiées sur des gènes avec les résultats biologiques ultérieurs.

Le développement de systèmes biologiques humains pour détecter et minimiser les effets biologiques involontaires de l’édition du génome est un objectif majeur du Consortium SCGE Bien que des progrès substantiels aient été accomplis en ce qui concerne les méthodes de définition des mutations hors cible à l’échelle du génome induites par les éditeurs de génome les conséquences associées à ces mutations au sein des cellules humaines restent un défi majeur141 De plus, d’autres effets des éditeurs ou des composants d’administration eux-mêmesy compris le potentiel de stimuler les réponses immunitaires38,39,43,44,45,142n’ont pas été entièrement caractérisés Le Consortium SCGE travaille au développement de plates-formes à base de cellules humaines et d’organoïdes pour définir les effets biologiques non intentionnels de l’édition (Tableau 3)

Les projets utilisent des cellules primaires humaines lorsque cela est possible Par exemple, une plate-forme de cellules T primaires définira certains des effets biologiques non intentionnels des éditeurs de génome Les cellules T se prêtent facilement à des méthodes sensibles et impartiales pour définir les activités des éditeurs à l’échelle du génome143, et des réarrangements génomiques uniques qui établissent un répertoire de récepteurs de cellules T diversifié peuvent servir de codes-barres cellulaires, facilitant l’analyse d’une cellule unique Des criblages ex vivo pour une réponse immunitaire adaptative des lymphocytes T aux éditeurs peuvent également être facilement mis en œuvre Lorsque les cellules primaires du tissu cible concerné sont limitantes, les bio-ingénieurs du consortium SCGE utiliseront des cellules humaines auto-renouvelables pour construire des organoïdes tridimensionnels fonctionnels ou des systèmes microphysiologiques. Ces plates-formes peuvent rassembler plusieurs types de cellules et matrices extracellulaires dans une architecture de type tissu, fournissant une imitation in vitro de tissus humains complexes. Des tests fonctionnels pertinents avec ces systèmes peuvent être définis, tels que la génération de force à partir du muscle squelettique, la contraction du tissu cardiaque et la phototransduction dans les organoïdes rétiniens144,145 Ces systèmes peuvent être étendus pour permettre des études à un débit plus élevé que ce qui serait faisable dans les modèles animaux, et peuvent également faciliter une caractérisation moléculaire plus approfondie des divers résultats après la modification de différents types de cellules humaines dans un tissu. Un objectif ultime de ces études est de produire des tests pertinents pour la science réglementaire, afin de mieux évaluer diverses stratégies d’édition du génome. Des études antérieures impliquant des souris immunodéficientes et des lymphocytes T modifiés ont largement permis de développer de nombreux produits de thérapie par cellules immunitaires, et tout nouveau système biologique développé par le Consortium SCGE, une fois établi, pourrait également permettre des études visant à des demandes de nouveaux médicaments expérimentaux. dans cet espace cellulaire et de thérapie génique

Les initiatives décrites ci-dessusles nouvelles plates-formes d’édition, les technologies de livraison, les systèmes de rapporteurs in vivo et les systèmes biologiques humainsdevraient se recombiner et se synergiser de multiples manières, planifiées et spontanées. Un exemple marquant, découlant de la reconnaissance toujours croissante de la nécessité d’une plus grande reproductibilité lors de la traduction clinique146, est une exigence explicite de validation indépendante pour toutes les technologies d’administration en développement. Chaque projet de livraison comprend plusieurs phases: une phase initiale qui établit la preuve de principe au sein de chaque laboratoire qui développe une technologie de livraison; une phase intermédiaire qui implique des tests dans un SATC, effectués par le personnel du SATC; and finally, pour les technologies qui respectent les jalons d’efficacité prédéfinis du SATC, la mise à l’échelle du système de distribution et les tests dans un LATC Les tests sur les grands animaux dépendent de la réussite de la validation indépendante de la technologie par un SATCâ ???? c’est-à-dire en dehors du laboratoire qui a développé le système de livraison en question. Dans un autre exemple, les chercheurs qui développent de nouveaux éditeurs pourraient choisir d’appliquer des systèmes de livraison nouvellement développés pour permettre des tests in vivo; les groupes de livraison peuvent utiliser des systèmes biologiques humains pour évaluer les performances et les conséquences néfastes avant de commencer les tests sur les animaux; et des systèmes biologiques humains pourraient être développés pour évaluer la précision d’édition des nouvelles plates-formes d’édition Ces projets intégrés et inter-équipes sont nourris par des appels internes au sein du Consortium SCGE pour discuter des propositions de collaboration chaque année.

Bien que les activités ci-dessus génèrent un large éventail de données et d’outils, l’impact maximal ne sera atteint que lorsque les technologies SCGE utilisent des normes communes et sont interopérables Les normes de données et de ressources et les lexiques partagés sont impératifs pour le développement de nouvelles technologies, et seront particulièrement essentiels pour traduire les systèmes d’édition du génome en thérapies approuvées147,148 Pour garantir des données de la plus haute qualité, l’interopérabilité des outils et la reproductibilité, le Centre de diffusion et de coordination (DCC) du Consortium SCGE sert de centre de communication, facilite la collaboration entre les membres du consortium et construit des plates-formes pour permettre le partage du programme SCGE. ressources et données, notamment via la boîte à outils SCGE De plus, pour contribuer à l’élaboration de normes, le Consortium SCGE s’interface avec la Food and Drug Administration, le National Institute of Standards and Technology (NIST) et la Defense Advanced Research Projects Agency. In particular, le Consortium SCGE est membre du NIST Genome Editing Consortium

La boîte à outils SCGE (Fig 1b) sera généré pour développer l’infrastructure et les données afin de promouvoir les collaborations entre les différents projets au sein du Consortium SCGE, et pour créer une plate-forme permettant aux chercheurs (et éventuellement à la communauté scientifique au sens large et au public) d’accéder aux données générées par le programme Pour garantir l’intégration des données et des outils d’exploitation minière fonctionnels, des formats de données et des vocabulaires normalisés sont en cours d’élaboration et seront mis à disposition sur le site Web du Consortium SCGE Il y aura plusieurs composants de la boîte à outils SCGE, y compris un portail de ressources public pour fournir aux membres du consortium et aux autres chercheurs un guichet unique pour obtenir des informations sur les référentiels de données existants, les outils publics et les algorithmes utilisés dans la recherche d’édition du génome. Les chercheurs du Consortium SCGE soumettront des données à ces ressources existantes lorsqu’elles seront disponibles Au fur et à mesure que ces composants sont testés, validés et utilisés ensemble dans des procédures expérimentales, ils seront intégrés dans une base de données centralisée pour le consortium SCGE et le public, facilitant la comparaison des résultats entre les expériences et permettant aux chercheurs d’affiner davantage les conceptions expérimentales pour l’édition du génome. recherche Étant donné qu’une grande partie du développement clinique en cours de l’édition du génome se déroule au sein de l’industrie, le consortium SCGE cherche à fournir des données, des outils, des systèmes et des tests largement accessibles qui pourraient permettre une approche plus ouverte pour le développement clinique.

De nouvelles opportunités pour la traduction clinique des technologies d’édition du génome découlent d’une compréhension plus approfondie du génome humain et de l’évolution rapide des capacités de bioingénierie. Le Consortium SCGE vise à développer de nouvelles technologies et à adapter les outils existants pour profiter immédiatement de ces opportunités, définir et atténuer les risques de sécurité et étendre l’édition thérapeutique du génome dans les contextes tissulaires somatiques les plus difficiles. Des projets antérieurs à grande échelle149,150,151,152,153,154,155 ont fait progresser les frontières de la génomique non seulement en produisant de nouvelles connaissances, mais aussi en développant un cadre commun garantissant la reproductibilité, appliquant des normes communes et établissant l’interopérabilité de technologies distinctes. Inspiré par ces efforts, le programme SCGE est conçu pour faire progresser le domaine de l’édition du génome vers un spectre élargi d’applications thérapeutiques humaines.

Les données du consortium seront déposées dans des bases de données publiques, et également mises à disposition en ligne via la boîte à outils SCGE (https: // scgemcwedu / toolkit), comme décrit dans la politique de partage de données SCGE (disponible sur https: // scgemcwéducation / politiques /; périodiquement mis à jour et amendé par les membres du Consortium SCGE)

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Section d’imagerie cellulaire et programme de biologie vasculaire, Institute for Cell Engineering, Johns Hopkins University School of Medicine, Baltimore, MD, United States

Division des sciences de la reproduction et du développement, Centre national de recherche sur les primates de l’Oregon, Université de la santé et des sciences de l’Oregon, Beaverton, OR, United States

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Bureau des programmes d’infrastructure de recherche, Division de la coordination des programmes, de la planification et des initiatives stratégiques, Bureau du directeur, Instituts nationaux de la santé, Bethesda, MD, United States

Institut de recherche Robarts et Département de biophysique médicale, Université de Western Ontario, London, Ontario, Canada

Département de biologie moléculaire, cellulaire et cancéreuse, faculté de médecine de l’Université du Massachusetts, Worcester, Worcester, MA, United States

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Correspondance avec
Krishanu Saha ou Erik J Sontheimer

KS reçoit un soutien à la recherche sponsorisé par Spotlight Therapeutics EJS est co-fondateur et conseiller d’Intellia Therapeutics CUNEg est co-fondateur de Tune Therapeutics, Element Genomics et Locus Biosciences, et conseiller de Sarepta Therapeutics, Levo Therapeutics et Iveric Bio réRL est cofondateur ou fondateur et conseiller scientifique d’Editas Medicine, Pairwise Plants, Beam Therapeutics et Prime Medicine SQT est membre du conseil consultatif scientifique de Kromatid, Inc régUNE est co-fondateur de CRISPR Therapeutics, Sigilon, Verseau, VasoRx et Orna, et consultant pour Translate Bio et Obsidian Therapeutics UNEUNE est co-fondateur de StrideBio et TorqueBio, et conseiller d’AstraZeneca, Sarepta Therapeutics, Gemini Therapeutics et BridgeBio JFB est co-fondateur de Metagenomi JWMB reçoit le soutien de la recherche de NovaDip Biosciences, Philips Healthcare et Weinberg Medical Physics réFC et JC sont des employés et des actionnaires de Recombinetics, Inc JEré est co-fondateur de Guide Therapeutics KJC est co-fondateur de Recombinetics, Inc et LifEngine Technologies BEré est membre du conseil scientifique de Tevard Biosciences JUNEré est cofondateur de Caribou Biosciences, Editas Medicine, Scribe Therapeutics, Intellia Therapeutics et Mammoth Biosciences; un membre du conseil consultatif scientifique de Caribou Biosciences, Intellia Therapeutics, eFFECTOR Therapeutics, Scribe Therapeutics, Mammoth Biosciences, Synthego, Algen Biotechnologies, Felix Biosciences et Inari; un directeur chez Johnson & Johnson; et a des projets de recherche parrainés par Biogen, Pfizer, AppleTree Partners et Roche SCE est co-fondateur et PDG de LifEngine Technologies, co-fondateur de LEAH Labs et directeur scientifique de Mettaforge Therapeutics réMg est co-fondateur et conseiller scientifique en chef d’Opsis Therapeutics et détient des participations dans cette société, et reçoit également un soutien à la recherche sponsorisé par Ascidian Therapeutics gg est un co-fondateur scientifique de Voyager Therapeutics, Adrenas Therapeutics et Aspa Therapeutics PMg est co-fondateur de Cybrexa Therapeutics et Delmab Bio et conseiller de pHLIP, Inc PBM est membre du conseil consultatif scientifique et reçoit le soutien de la recherche sponsorisée de Spirovant Sciences, Inc SK est le directeur scientifique et co-fondateur de SafeGen Therapeutics WMS est co-fondateur et reçoit le soutien de la recherche de Stradefy Biosciences JKW est consultant pour Flagship Pioneering

Information sur l’évaluation par les pairs La nature remercie Fyodor Urnov et le (s) other (s) critique (s) anonyme (s) pour leur contribution à l’évaluation par les pairs de ce travail

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Saha, K, Sontheimer, EJ, Brooks, PJ et al Le programme NIH Somatic Cell Genome Editing
Nature 592, 195â ???? 204 (2021) https: // doiorg / 101038 / s41586-021-03191-1

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ISSN 1476-4687 (online)

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Genome modification, acide nucléique peptidique, acide nucléique, genetic, research, biology, ADN

News – United States – Le programme NIH Somatic Cell Genome Editing
Associated title :
Carnegie Mellon / La technique basée sur Yale PNA est une partie essentielle de la boîte à outils d’édition de gènes
The NIH Somatic Cell Genome Editing program
technique basée sur PNA une partie essentielle de la boîte à outils d’édition de gène

Source: https://www.nature.com/articles/s41586-021-03191-1

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