Actualités – États-Unis – La modification de Cas9 peut améliorer l’efficacité de l’édition génique

4 décembre 2020 – Une modification des systèmes CRISPR / Cas9 peut améliorer leur fonctionnalité pour l’édition de gènes dans la réparation de l’ADN, selon un rapport publié dans Nature Communications le 27 novembre La nouvelle variante Cas9 améliore également la sécurité du système pour les applications d’édition de gènes de précision

Les nucléases d’édition génique telles que CRISPR / Cas9 peuvent créer efficacement des cassures double brin au niveau d’un locus cible dans le génome Souvent, les cassures double brin sont ensuite réparées par les mécanismes de jonction d’extrémité non homologues, conduisant à des insertions et des délétions (indels) Une stratégie, appelée réparation dirigée par homologie (HDR), est utilisée pour obtenir des modèles de knock-in de gène (insertion de gène ciblée)

Ces techniques d’édition de gènes sont relativement efficaces pour l’hybridation simple brin, comme c’est souvent le cas avec Streptococcus pyogenes Cas9 (spCas9) Alternativement, les taux d’efficacité des nucléases d’édition génique pour le knock-in médié par l’ADN double brin par recombinaison homologue sont faibles et doivent être améliorés

Pour améliorer l’efficacité de spCas9, les stratégies précédentes impliquaient de fusionner les modules clés nécessaires à la voie HDR vers spCas9 Bien que cela ait généralement augmenté les taux de knock-ins double brin réussis, il est accompagné d’indels hors cible, réduisant ainsi la précision du système. De plus, les modules de fusion sont souvent volumineux (plus de 100 acides aminés), ce qui pose un défi pour l’efficacité de l’empaquetage et de la transduction via l’administration de virus adéno-associés (AAV).

Lors de la recombinaison homologue, les filaments nucléoprotéiques de la protéine RAD51 / ADN simple brin effectuent la recherche d’homologie et l’échange de brins Un motif contenant 36 acides aminés codés par BRCA2 Exon 27 (Brex27) aide à stabiliser ces filaments pendant le processus

Des chercheurs de l’Université du Michigan ont émis l’hypothèse que la fusion du Brex27 à la spCas9 conduirait à un enrichissement local de RAD51 et à la stabilisation des filaments nucléoprotéiques RAD51 / ADN simple brin aux sites de rupture sur cible et hors cible induits par Cas9 Ils pensaient que cela serait bénéfique pour réduire les événements indel indésirables sur cible et hors cible et améliorer les taux de knock-in double brin.

Pour explorer cette possibilité, les scientifiques ont construit un variant d’ADN plasmidique exprimant miCas9 (ADNp) qui pourrait être comparé à l’ADNp plus traditionnel exprimant spCas9. Ils ont commencé par comparer les différentes nucléases pour l’efficacité à frapper dans un gène de protéine fluorescente verte (GFP) au locus du site d’intégration AAV 1 (AAVS1) dans les cellules humaines. Ils ont constaté que l’utilisation de miCas9 améliorait constamment le taux de knock-in de la GFP de deux à trois fois dans plusieurs types de cellules.

Les dommages indel ciblés sont une préoccupation potentielle de l’édition de gènes, car ils peuvent empêcher les corrections ciblées de se produire Par rapport aux autres variantes de Cas9, la variante miCas9 a toujours atteint les taux d’indel sur cible les plus bas, qui étaient jusqu’à 75% inférieurs à ceux de spCas9 La variante miCas9 a également réduit efficacement les taux d’indels à tous les locus hors cible que les chercheurs ont examinés, par rapport à spCas9

Les chercheurs ont en outre démontré que Brex27 (mini motif) peut être utilisé comme module plug-and-play pour améliorer l’efficacité d’autres nucléases d’édition de gènes (miHiFiCas9, miCas9mSA) L’ajout du Brex27 a entraîné jusqu’à 767% de réduction des taux indel hors cible par rapport aux spCas9

Les chercheurs ont expliqué que la taille miniature du Brex27 pourrait être avantageuse pour son éligibilité à la livraison par AAV (capacité d’emballage limitée de 47 kb) pour les thérapies géniques Le mini motif offre également plusieurs interactions synergiques avec les systèmes de nucléase d’édition de gènes préexistants

Il fournit un outil “une petite pierre pour trois oiseaux” dans l’édition de gènes, ont déclaré les auteurs

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